作業実績：ペプチドの受託合成におけるペプチド結合形成の原理
表面上、ペプチド結合の形成 (ジペプチドの生成) は単純な化学プロセスです。 これは、2つのアミノ酸成分がペプチド結合（アミド結合）で結合し、同時に脱水されることを意味します。
ペプチド結合の形成は、穏やかな反応条件下でのアミノ酸の活性化です。 (A) カルボキシル部分、2 番目のアミノ酸 (B)、そして求核的に活性化されたカルボキシル部分がジペプチド (A-B) を形成します。 (A)カルボキシル成分が保護されていないと、ペプチド結合形成を制御することができません。 直鎖状ペプチドや環状ペプチドなどの副産物が標的化合物 A ～ B と混合する場合があります。
したがって、ペプチド合成中のペプチド結合形成に関与しないすべての官能基は、一時的に可逆的な方法で保護する必要があります。カスタムペプチド合成中にペプチド結合がどのように形成されるかを以下に示します。
ペプチドの受託合成におけるペプチド結合形成の原理
したがって、ペプチド合成、つまり各ペプチド結合の形成は、3 つの凝集ステップで構成されます。
最初のステップは、保護する必要があるいくつかのアミノ酸を準備することです。アミノ酸の両性イオン構造はもはや存在しません。
第 2 ステップは、ペプチド結合を形成するための 2 段階の反応です。最初に N 保護アミノ酸のカルボキシル基が活性中間体として活性化され、次にペプチド結合を形成します。 このカップリング反応は、1 段階反応または 2 つの連続反応のいずれかで行うことができます。
第三のステップは、保護基を選択的に除去または完全に除去することです。 すべての除去はすべてのペプチド鎖が組み立てられた後にのみ行うことができますが、ペプチド合成を続行するには保護基の選択的な除去も必要です。
10 個のアミノ酸 (Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec、および Cys) には選択的保護を必要とする側鎖官能基が含まれているため、ペプチド合成はさらに複雑になります。 選択性の要件が異なるため、一時的保護基地と半永久的保護基地を区別する必要があります。
一時的な保護基は、次のステップでのアミノ酸またはカルボキシル官能基の一時的な保護を反映するために使用されます。 半永久的な保護基は、形成されたペプチド結合やアミノ酸側鎖を妨げることなく、場合によっては合成中に除去されます。
理想的には、カルボキシル成分の活性化とそれに続くペプチド結合の形成 (カップリング反応) は、ラセミ化や副生成物の形成がなく、高収率を得るためにモル反応物が適用されることなく迅速な反応である必要があります。 残念ながら、これらの要件を満たすことができる化学カップリング法はなく、実際の合成に適したものはほとんどありません。
ペプチドの受託合成におけるペプチド結合形成の原理
ペプチド合成中、さまざまな反応に関与する官能基が手動中心に結合されることが多く (グリシンは唯一の例外です)、回転の潜在的なリスクがあります。
ペプチド合成サイクルの最終ステップは、すべての保護基を除去することです。 保護基の選択的除去は、ジペプチド合成における保護基の完全な除去に加えて、ペプチド鎖の伸長にも重要です。
合成戦略は慎重に計画する必要があります。 戦略的な選択に応じて、N はα-アミノ保護基またはカルボキシル保護基を選択的に除去できます。 「戦略」という用語は、個々のアミノ酸の縮合反応の順序を指します。 一般に、プログレッシブ合成とフラグメント凝縮には違いがあります。
ペプチド合成 (「従来の合成」とも呼ばれます) は溶液中で行われます。 ほとんどの場合、ペプチド鎖の段階的な伸長は、ペプチド鎖を使用してより短いフラグメントを合成することによってのみ合成できます。 より長いペプチドを合成するには、標的分子を適切なフラグメントに分割し、C 末端での分化の程度を最小限に抑えることができるかどうかを確認する必要があります。
個々のフラグメントが徐々に組み立てられた後、目的の化合物が結合されます。 ペプチド合成の戦略には、最適かつ最適な保護フラグメントの選択が含まれ、ペプチド合成の戦略には、最も適切な保護基の組み合わせと最適なフラグメントカップリング法の選択が含まれます。
ペプチド抗原の設計はどのように行うのですか?
ペプチド抗原スキームの中核は、ペプチドの選択とエピトープの設計です。 Omizzur は、ペプチド抗原の合成において 10 年以上の経験があります。 抗体の使用を組み合わせ、相同性、親水性、分子量、構造、純度、長さなどを考慮し、最適な抗原を設計・製造いたします。
抗原設計理論
抗原性とは、抗原が、抗原によって誘導された抗体またはプライムリンパ球と特異的に結合する能力を指します。抗原性の強さは、抗原決定基の分子サイズ、化学組成、構造と密接に関係しています。
免疫原性とは、身体を刺激して特定の抗体またはプライムリンパ球を形成する能力を指します。優れたペプチド抗原は、特定の免疫細胞を刺激し、免疫細胞を活性化、増殖、分化させ、最終的には特定の抗体を産生し、
プライミングされたリンパ球。
抗原決定基
免疫系に抗体を産生させるタンパク質の表面上の領域は、抗原決定基と呼ばれます。天然の抗原には複数の決定基がある場合があります。
抗原分子が大きくなるほど、抗原決定基の量が多くなります。構造が明確な抗原決定基をエピトープといいます。アミノ酸の統計データ（表面接近性、親水性、柔軟性）やタンパク質の高次構造（βベンドなど）の予測に基づいて、抗原決定基の面積をある程度計算することができます。
ペプチド抗原の設計思想
抗体の効果を最大限に引き出すためには、抗原ペプチドを徹底的に設計することが重要です。 設計は主な条件を満たす必要があります。つまり、抗原は強すぎる免疫反応を生成せず、免疫の過程で目的のタンパク質に結合する能力を備えた抗体を生成することもできます。Omizzur の長年の経験に基づいて、ここでは参考となるいくつかの重要な基本設計原則を示します。
1.相同性
設計したペプチド配列は、免疫した宿主のタンパク質配列や、それ自体の種の他のタンパク質配列と相同性がありません。NCBI BLAST により配列アライメントを実現します。
2.親水性
すべてのタンパク質は、表面に親水性領域、内部に疎水性領域を露出しています。そのため、水相への溶解性を高め、免疫反応を刺激するために、設計されたペプチドは良好な親水性を備えている必要があります。（親水性は、当社の抗原決定基予測ツールで予測できます）
3. ペプチド末端
通常、タンパク質全体ではN末端とC末端の両方がタンパク質表面に露出していますが、C末端はある程度疎水性であるため、抗体を産生しやすいN末端を選択することができます。
4. ペプチドの構造
配列はαヘリックスを形成せず、内部セグメントを複製します。
5. 長さと純度
タンパク質の加水分解を防ぎ、エピトープを確実にカバーするために、ペプチド抗原は通常8～20アミノ酸で設計されています。長さが短すぎると抗体と天然タンパク質との親和性が十分に強くならず、長すぎると二次構造が生じる可能性があります。
抗体の産生に使用されるペプチドの純度は 85% 以上が適切です。
6. シーケンスの最適化
配列にはMHC分子（主要組織適合性複合体）が好むAsp、Tyr、Pheなどが含まれています。グリコシル化されやすいアミノ酸（Asn、Ser、Thr、リン酸化アミノ酸など）は避けてください。適切なProはペプチド配列の安定性に優れています。
7. キャリアリンカー
ペプチド抗原と高分子タンパク質などの担体を結合させることで免疫原性を獲得できます。一般的には、抗体産生への影響が少ないペプチド鎖の末端にリンカーアームを付加して、ペプチドと担体との結合を促進します。配列中にCysを含まないN末端またはC末端にCysを付加する方法が好ましい方法です。
ペプチド精製における 13 のよくある質問と回答
1. ペプチドの純度を検出する一般的な方法は何ですか?
通常、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によって測定されます。
2. ペプチド含有量とペプチド純度の違いは何ですか?
ペプチドには、適切なペプチドだけでなく、製造時に水や有機塩などの不純物も含まれています。 ペプチド純度は、すべての不純物 (水を除く) に対するペプチドの正しい量を指します。 ただし、ペプチド含有量はサンプル中の他のすべての物質に対する標的ペプチドの割合であり、通常は N 要素分析とアミノ酸分析によって決定されます。 したがって、ペプチド純度が 99% に達しても、水や有機塩を考慮すると、含有量は 70% ～ 80% になる可能性があります。
3. ペプチドの単離と精製に最も一般的に使用される技術は何ですか?
最も一般的な技術は、逆相高速液体クロマトグラフィー (RP-HPLC) です。
4. RP-HPLC でのペプチドの単離と精製にはどの移動相が一般的に使用されますか?
最も一般的な移動相は水とアセトニトリルで、トリフルオロ酢酸がイオンペア試薬として機能します。 異なるペプチドセグメントに応じて、適切な勾配溶出を使用して分離しました。
5. TFA がイオンペア試薬として移動相に追加されるのはなぜですか?
ペプチドの分離と精製に利用できる他の移動相またはイオンペア試薬はありますか? TFA は、ペプチドと相互作用して分離効果を高め、ピーク形状を大幅に改善するためのイオンペア試薬として移動相の pH を調整するために使用できます。 ペプチドの分離精製に使用される他の移動相またはイオンペア試薬には、酢酸系、リン酸系、塩酸系、ヘプタフルオロ酪酸などがあり、pHを調整することで良好な分離効果を得ることができます。
6. ペプチドを溶解するにはどうすればよいですか?
ほとんどのペプチドは超純水に溶解できます。 一部の不溶性ペプチドについては、最初にアミノ酸配列を分析する必要があります。 酸性ペプチドは、少量のアルカリ溶液 (例: 0.1% アンモニア) に溶解し、目的の濃度に希釈します。 塩基性ペプチドとして、少量の酸性溶液（酢酸、トリフルオロ酢酸など）に溶解し、目的の濃度に希釈します。 疎水性ペプチドの場合、DMF、メタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、DMSOなどの強極性有機溶媒に可溶です。
7. RP-HPLC で一般的に使用されるクロマトグラフィー充填剤は何ですか?
最も一般的なフィラーは、C18、C8、および C4 逆相カラムです。
8. 精製におけるクロマトグラフィー充填剤はどのように選択すればよいですか?
異なる配列を持つペプチドの物理化学的特性と疎水性は大きく異なります。 ほとんどの場合、C18 カラムは、分子量 4000 未満または親水性のペプチドの分離に最適です。 C4 カラムは、5000 を超える分子量または疎水性末端に適しています。 C8 カラムは C18 と C4 の間にあり、その効果は C18 により似ています。 一部の特殊な選択ペプチドについては、フェニルおよびポリマーカラムも選択できます。
9. 精製におけるポリマーフィラーの選択原理は何ですか?
より高い pH または温度が必要な場合、広い pH 範囲を備えたポリマー HPLC カラムが精製に適している場合があります。 これらは極端な pH 条件でも分解しないため、強酸および強塩基を移動相として使用して分離および精製できます。
10. ペプチド精製の結果に何が影響しますか?
移動相、カラムの種類、カラム温度、波長、クロマトグラフの性能など、多くの影響要因があります。 これらの違いにより、最終結果にエラーが生じる可能性があります
11. 逆相クロマトグラフィーによる精製後、最終生成物の移動相から TFA やアセトニトリルなどの不純物を除去するにはどうすればよいですか?
許容範囲を超えない限り、凍結乾燥はおそらく、ほとんどの TFA とアセトニトリルを除去する最も簡単で効果的な方法です。 ただし、この方法では、TFA 含有量が高い一部のペプチド医薬品の要件を満たすことができません。 特別な塩変換と脱塩をそれらとともに実行する必要があります。
12. ペプチドの食塩の形態は何ですか? 塩の形に変換または脱塩するにはどうすればよいですか?
ほとんどのペプチドは TFA システムで精製されるため、TFA 塩が最も一般的な形態であり、酢酸塩および塩酸塩の形態がそれに続き、特殊な塩の形態であるペプチド医薬品はほとんどありません。 イオン交換と HPLC は、最も一般的に使用される塩変換方法です。
13. サンプルカラムにロードする前にペプチドサンプルを前処理する必要があるのはなぜですか?
準備方法にはどのようなものがありますか? 分取カラムは分析カラムよりも多くのサンプルを処理するため、汚染される可能性が高くなります。 したがって、カラムの使用時間を延長するにはサンプルを前処理する必要があります。 濾過、遠心分離、プレカラム濾過、オンライン濾過の 5 つの主な方法がありますの上。
ペプチドに関するさらに詳しい知識については、当社の研究室をご覧ください: Omizzur
How to choose the right purity for custom peptides?
In research and development using peptides, how much purity should be selected for peptide synthesis, and is the purity of the selected peptide the higher the better?
In general, the same sequence, the same number of peptides will vary in price because of its purity, the higher the purity, the higher the price of the peptide per unit quality.
Our company can provide different purity levels for customers to choose from, from crude to >98% purity. According to customer needs, we can provide ultra-pure peptides with purity >98%.
Crude peptides are not recommended for use in biological experiments. Crude peptides may contain large amounts of non-peptide impurities, such as residual organic solvents, scavengers, TFA, and other incomplete peptides. TFA cannot be completely eliminated, and peptides are usually delivered in the form of TFA salts.If residual TFA affects your experiment, we recommend other salt forms such as acetate and hydrochloride. These salts are typically more than 20-30% more expensive than regular TFA salts. This is due to more peptide loss and the need for more raw materials during the conversion process.
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